7.1. Cinética enzimática: concepto y medida de la velocidad
La cinética enzimática es el estudio cuantitativo de la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas y de los factores que la modifican. Permite caracterizar matemáticamente el comportamiento de un enzima, comparar distintos enzimas entre sí y entender cómo se regula el metabolismo.
La velocidad de una reacción enzimática se define como el cambio en la concentración de sustrato o producto por unidad de tiempo:
v = −d[S]/dt = d[P]/dt
En la práctica se mide la velocidad inicial (v₀): la velocidad al comienzo de la reacción, cuando la concentración de sustrato es prácticamente constante y la concentración de producto es despreciable. Esto simplifica el análisis porque elimina la reacción inversa y los efectos de inhibición por producto.
Las condiciones experimentales estándar para medir la cinética son: concentración de enzima muy baja (10⁻⁸ a 10⁻¹² M), temperatura y pH controlados, y concentración de sustrato variable. Se construye una curva de saturación midiendo v₀ a distintas concentraciones de sustrato [S].
7.2. El modelo de Michaelis-Menten
7.2.1. Supuestos del modelo
En 1913, Leonor Michaelis y Maud Menten propusieron un modelo cinético para describir las reacciones enzimáticas. El modelo se basa en el siguiente esquema de reacción:
E + S ⇌ ES → E + P
El enzima (E) se une al sustrato (S) formando un complejo enzima-sustrato (ES), que se disocia generando el producto (P) y liberando el enzima libre.
Los supuestos del modelo son:
La concentración de [ES] es constante durante la reacción — es el supuesto del estado estacionario: la velocidad de formación del complejo ES es igual a su velocidad de destrucción.
Cuando [S] es saturante, prácticamente todo el enzima está en forma ES — la concentración de enzima libre es despreciable.
El paso ES → E + P es irreversible al inicio de la reacción, cuando la concentración de producto es prácticamente cero.
7.2.2. La ecuación de Michaelis-Menten
A partir de estos supuestos se deriva la ecuación fundamental de la cinética enzimática:
v = Vmax · [S] / (Km + [S])
Esta ecuación describe una hipérbola rectangular: a concentraciones de sustrato bajas la velocidad aumenta casi linealmente con [S]; a concentraciones altas la velocidad se aproxima asintóticamente a Vmax.
Dos casos límite ilustran el comportamiento:
Cuando [S] << Km: v ≈ (Vmax/Km) · [S] — la velocidad es proporcional a [S], cinética de primer orden.
Cuando [S] >> Km: v ≈ Vmax — la velocidad es independiente de [S], cinética de orden cero. El enzima está saturado.
Cuando [S] = Km: v = Vmax/2 — definición operativa de Km.
7.2.3. Significado de Km y Vmax
La Km (constante de Michaelis) es la concentración de sustrato a la que la velocidad es la mitad de Vmax. Tiene las siguientes implicaciones:
Es un indicador de la afinidad del enzima por el sustrato: a menor Km, mayor afinidad (se necesita menos sustrato para alcanzar la mitad de la velocidad máxima). A mayor Km, menor afinidad.
Permite comparar la afinidad de un enzima por distintos sustratos y la afinidad de distintos enzimas por el mismo sustrato.
Es determinable experimentalmente con relativa facilidad.
Las concentraciones fisiológicas de los sustratos son generalmente del mismo orden de magnitud que la Km de sus enzimas — esto garantiza que los enzimas operen en la zona sensible de la curva, donde pequeñas variaciones de [S] producen cambios apreciables en la velocidad.
La Vmax es la velocidad máxima de la reacción cuando todo el enzima está en forma ES. Es proporcional a la concentración total de enzima [ET]:
Vmax = kcat · [ET]
A diferencia de Km, Vmax no es una constante intrínseca del enzima — depende de cuánto enzima haya presente. Si se duplica la cantidad de enzima, Vmax se duplica.
7.2.4. El número de recambio (kcat)
El kcat (también llamado constante catalítica o número de recambio) es el número de moléculas de sustrato que transforma una molécula de enzima por unidad de tiempo cuando está completamente saturada:
kcat = Vmax / [ET]
Las unidades de kcat son s⁻¹ (o min⁻¹). Su inversa, 1/kcat, define el tiempo mínimo necesario para que una molécula de enzima complete un ciclo catalítico.
El cociente kcat/Km es la eficiencia catalítica — el parámetro que mejor describe la capacidad de un enzima para actuar sobre un sustrato a concentraciones fisiológicas (cuando [S] << Km). Permite comparar enzimas que actúan sobre distintos sustratos. El límite teórico de kcat/Km está impuesto por la velocidad de difusión (~10⁸–10⁹ M⁻¹s⁻¹) — los enzimas que alcanzan este límite se denominan catalíticamente perfectos (ej. triosafosfato isomerasa).
| Parámetro | Definición | Unidades | Significado práctico |
|---|---|---|---|
| Km | Concentración de sustrato a la que $v = V_{max}/2$ | M (mol/L) o mM | Indicador inverso de afinidad: Km baja = alta afinidad. Permite comparar sustratos y enzimas. |
| Vmax | Velocidad cuando todo el enzima está saturado de sustrato | μmol/min o nmol/s | Proporcional a $[E_T]$. No es constante intrínseca del enzima — depende de cuánto enzima hay. |
| kcat | Número de ciclos catalíticos por molécula de enzima por segundo cuando está saturada | s⁻¹ | Velocidad intrínseca del enzima. Su inversa = tiempo mínimo por ciclo catalítico. |
| kcat/Km | Cociente entre número de recambio y constante de Michaelis | M⁻¹·s⁻¹ | Mide la eficiencia a concentraciones fisiológicas ([S] << Km). Límite difusional: ~$10^8$–$10^9$ M⁻¹s⁻¹. |
Km mide afinidad (inversamente). Vmax mide capacidad máxima (dependiente de [ET]). kcat mide velocidad por molécula de enzima. kcat/Km mide eficiencia catalítica global.
7.3. Representación de Lineweaver-Burk
La curva hiperbólica de Michaelis-Menten dificulta la determinación gráfica precisa de Km y Vmax. La representación de Lineweaver-Burk o representación del doble recíproco resuelve este problema transformando la ecuación hiperbólica en una ecuación lineal.
Tomando los inversos de ambos lados de la ecuación de Michaelis-Menten:
1/v = (Km/Vmax) · (1/[S]) + 1/Vmax
Esta es la ecuación de una recta de la forma y = mx + b, donde:
- Eje Y: 1/v
- Eje X: 1/[S]
- Pendiente: Km/Vmax
- Intersección con el eje Y: 1/Vmax
- Intersección con el eje X: −1/Km
La representación de Lineweaver-Burk tiene un valor práctico fundamental: permite identificar el tipo de inhibición enzimática por el patrón de cambio de las intersecciones al añadir un inhibidor, algo que se desarrollará en T8 – .
| Elemento | Expresión matemática | Cómo se obtiene | Valor cinético |
|---|---|---|---|
| Eje Y (ordenada) | $1/v$ | Variable dependiente — inverso de la velocidad | — |
| Eje X (abscisa) | $1/[S]$ | Variable independiente — inverso de la concentración de sustrato | — |
| Pendiente de la recta | $K_m / V_{max}$ | Calculada a partir de dos puntos de la recta | Relaciona $K_m$ y $V_{max}$ |
| Intersección con eje Y | $1 / V_{max}$ | Punto donde $1/[S] = 0$ (extrapolado) | Permite calcular $V_{max}$ directamente |
| Intersección con eje X | $-1 / K_m$ | Punto donde $1/v = 0$ (extrapolado) | Permite calcular $K_m$ directamente |
La representación de Lineweaver-Burk magnifica los errores experimentales a concentraciones bajas de sustrato (valores altos de 1/[S]), donde la precisión es menor. En la práctica moderna se usan transformaciones alternativas (Eadie-Hofstee, Hanes-Woolf) o ajuste no lineal directo a la hipérbola de Michaelis-Menten.
7.4. Cinéticas que se apartan del modelo de Michaelis-Menten
7.4.1. Enzimas alostéricos y cooperatividad
Algunos enzimas no siguen la cinética hiperbólica de Michaelis-Menten. En lugar de la curva hiperbólica característica, presentan una curva sigmoidea (en forma de S) cuando se representa la velocidad frente a la concentración de sustrato.
Este comportamiento se denomina cooperatividad y es característico de los enzimas alostéricos (proteínas oligoméricas con múltiples sitios de unión al sustrato, uno por cada subunidad).
En la cooperatividad positiva, la unión de una molécula de sustrato a una subunidad provoca un cambio conformacional que aumenta la afinidad de las demás subunidades por el sustrato. El resultado es que a concentraciones bajas de sustrato la velocidad es muy lenta (todas las subunidades en estado de baja afinidad) pero en un intervalo estrecho de concentración la velocidad aumenta de forma muy brusca. Este comportamiento hace que los enzimas alostéricos funcionen como interruptores moleculares, responden de forma muy sensible a pequeños cambios en la concentración de sustrato.
En la cooperatividad negativa ocurre lo contrario: la unión de sustrato a una subunidad disminuye la afinidad de las demás. Es menos frecuente y tiene implicaciones reguladoras distintas.
La curva sigmoidea en un enzima es señal de cooperatividad. La cooperatividad positiva convierte al enzima en un interruptor sensible: pasa de actividad mínima a máxima en un rango estrecho de concentración de sustrato.
7.4.2. Modelos de cooperatividad
Se han propuesto dos modelos principales para explicar el mecanismo molecular de la cooperatividad:
Modelo concertado de Monod-Wyman-Changeux (MWC, 1965): el enzima existe en solo dos estados conformacionales globales que afectan a todas las subunidades simultáneamente: el estado T (tenso, baja afinidad) y el estado R (relajado, alta afinidad). En ausencia de sustrato predomina el estado T. La unión de sustrato estabiliza el estado R, desplazando el equilibrio T⇌R hacia R. El cambio es concertado — todas las subunidades cambian de estado al mismo tiempo, sin estados intermedios.
Modelo secuencial de Koshland-Némethy-Filmer (KNF, 1966): las subunidades cambian de conformación de forma independiente y secuencial al unirse el sustrato, una a una. Existen múltiples estados intermedios con distintas subunidades en diferentes conformaciones. Este modelo permite explicar tanto la cooperatividad positiva como la negativa.
| Característica | Modelo MWC (Monod, 1965) | Modelo KNF (Koshland, 1966) |
|---|---|---|
| Estados conformacionales | Solo dos estados globales: T (tenso, baja afinidad) y R (relajado, alta afinidad) | Múltiples estados intermedios — cada subunidad puede estar en T o R independientemente |
| Mecanismo del cambio | Concertado: todas las subunidades cambian de estado simultáneamente | Secuencial: las subunidades cambian una a una al unirse el sustrato |
| Estados intermedios | No existen — el oligómero es siempre todo-T o todo-R | Sí existen — combinaciones mixtas T/R son posibles |
| Cooperatividad negativa | No puede explicarla | Sí puede explicarla |
| Complejidad matemática | Menor — modelo más simple | Mayor — más parámetros |
7.5. Efecto del pH y la temperatura sobre la actividad enzimática
7.5.1. Efecto del pH
Cada enzima tiene un pH óptimo al que su actividad es máxima. A pH superior o inferior, la actividad disminuye de forma más o menos simétrica, generando una curva campaniforme.
El mecanismo es doble. Por un lado, el pH modifica la ionización de las cadenas laterales de los aminoácidos del centro activo — cambios de carga que alteran la geometría del sitio catalítico y la interacción con el sustrato. Por otro lado, a pH extremo se produce desnaturalización de la proteína.
El pH óptimo varía enormemente entre enzimas según su localización fisiológica: la pepsina gástrica actúa a pH ~2, la mayoría de enzimas intracelulares a pH 7-7,5, y la arginasa hepática a pH ~9,5.
7.5.2. Efecto de la temperatura
La relación entre temperatura y actividad enzimática tiene dos componentes opuestos que generan una curva con máximo:
A temperaturas bajas, la actividad aumenta con la temperatura porque la agitación térmica aumenta la frecuencia de colisiones enzima-sustrato y la energía disponible para superar la barrera de activación. Para muchas reacciones biológicas se cumple que la velocidad se duplica por cada 10°C de aumento (Q₁₀ ≈ 2).
A temperaturas altas, la actividad cae bruscamente porque el calor rompe los enlaces débiles que estabilizan la conformación nativa del enzima, produciendo desnaturalización. La temperatura a la que el enzima pierde actividad de forma irreversible es la temperatura de desnaturalización.
La temperatura óptima de la mayoría de enzimas humanos es ~37°C. En estados febriles la velocidad de las reacciones enzimáticas aumenta, lo que puede tener efectos tanto beneficiosos (respuesta inmune) como perjudiciales si la temperatura es excesiva.
Muchos enzimas existen en formas moleculares distintas denominadas isoenzimas o isozimas: variantes con la misma función catalítica pero diferente estructura, cinética o distribución tisular.
La lactato deshidrogenasa (LDH) existe en cinco isoformas (LDH1-LDH5) con distribución tisular específica: LDH1 predomina en corazón y eritrocitos, LDH5 en hígado y músculo esquelético. La creatinquinasa (CK) tiene tres isoformas: CK-MM (músculo), CK-MB (miocardio) y CK-BB (cerebro). La determinación de isoenzimas en plasma permite localizar el tejido dañado: una elevación de CK-MB es específica de daño miocárdico.
