28.1. Concepto de ingeniería genética
La ingeniería genética —también denominada tecnología del ADN recombinante, clonaje génico o manipulación génica— es el conjunto de técnicas que permite aislar, modificar, amplificar, clonar y expresar secuencias genéticas de forma controlada en el laboratorio.
Su desarrollo transformó la biología desde la década de 1970 y es hoy la base de la biología molecular experimental, el diagnóstico genético, la producción de fármacos y el desarrollo de terapias génicas.
Las herramientas fundamentales son las endonucleasas de restricción, los vectores de clonación, la PCR y las técnicas de secuenciación. A ellas se suma, en las últimas décadas, la edición génica mediante CRISPR-Cas9.
28.2. Endonucleasas de restricción
Las endonucleasas de restricción son enzimas bacterianas que reconocen y cortan el ADN en secuencias específicas, generalmente palindrómicas de 4 a 8 pares de bases. En las bacterias funcionan como sistema de defensa frente a bacteriófagos: degradan el ADN extraño mientras que el ADN propio está protegido por metilación en esas mismas secuencias.
En el laboratorio son herramientas esenciales para fragmentar el ADN de forma reproducible y predecible.
Según cómo realizan el corte, generan dos tipos de extremos:
Los extremos pegajosos (sticky ends) se producen cuando las dos hebras se cortan a distinta altura, dejando una región de cadena simple expuesta. Estos extremos son complementarios entre sí y facilitan la ligación con otros fragmentos cortados con la misma enzima.
Los extremos romos (blunt ends) se producen cuando ambas hebras se cortan exactamente al mismo nivel. No dejan cadena simple expuesta y son menos eficientes en las reacciones de ligación.
Las endonucleasas de restricción son el bisturí molecular de la ingeniería genética: cortan el ADN en posiciones exactas y predecibles, permitiendo aislar fragmentos específicos para clonar, analizar o manipular.
28.3. Vectores de clonación
Un vector de clonación es una molécula de ADN capaz de replicarse de forma autónoma en una célula huésped y que se utiliza para transportar e introducir un fragmento de ADN de interés en esa célula.
La elección del vector depende principalmente del tamaño del inserto que se quiere clonar y del organismo huésped.
| Vector | Tamaño de inserto | Huésped |
|---|---|---|
| Plásmido | Hasta 8-9 kb | E. coli |
| Fago λ | 12-22 kb | E. coli |
| Cósmido | Hasta 45 kb | E. coli |
| Fago P1 | 70-100 kb | E. coli |
| PAC | 130-150 kb | E. coli |
| BAC | 120-300 kb | E. coli |
| YAC | 250-400 kb | Levaduras |
Los plásmidos son los vectores más sencillos: moléculas circulares de ADN extracromosómico que se replican de forma independiente en bacterias. Son útiles para clonar fragmentos pequeños.
Los YAC (Yeast Artificial Chromosomes) permiten clonar fragmentos muy grandes y fueron esenciales en el Proyecto Genoma Humano. Se propagan en levaduras, no en E. coli.
28.4. Librerías genómicas y de ADNc
Una librería génica es una colección de clones que contiene, en conjunto, la totalidad o una fracción representativa del ADN de un organismo o de los ARNm expresados en un tipo celular.
28.4.1. Librería genómica (ADNg)
La librería genómica se construye a partir del ADN total extraído del organismo, fragmentado con endonucleasas de restricción e introducido en vectores. Contiene exones e intrones, así como regiones no codificantes. Es idéntica para todas las células de un mismo organismo, independientemente del tipo celular.
28.4.2. Librería de ADNc
La librería de ADNc se construye a partir de los ARNm expresados en un tipo celular concreto. Mediante una transcriptasa inversa, el ARNm se copia a ADN de cadena simple, que luego se convierte en ADN de doble cadena. El resultado es ADNc (ADN complementario), que contiene solo la secuencia codificante (exones) sin intrones.
La librería de ADNc es específica de cada tipo celular y del momento del desarrollo, porque refleja qué genes están siendo transcritos en ese contexto.
| Característica | ADNg | ADNc |
|---|---|---|
| Origen | ADN genómico total | ARNm expresado |
| Contiene intrones | Sí | No |
| Igual en todas las células | Sí | No — específico de tipo celular |
| Utilidad principal | Estructura del gen completo | Secuencia codificante, expresión |
28.5. PCR (reacción en cadena de la polimerasa)
La PCR (Polymerase Chain Reaction) es una técnica que permite amplificar in vitro millones de copias de una secuencia específica de ADN a partir de cantidades mínimas de material de partida, en pocas horas y sin necesidad de clonar en un organismo vivo.
Fue desarrollada por Kary Mullis en 1983, quien recibió el Nobel de Química en 1993.
Componentes de la reacción
- ADN molde: la secuencia que se quiere amplificar.
- Cebadores (primers): dos oligonucleótidos de cadena simple complementarios a los extremos de la región de interés, uno para cada hebra.
- ADN polimerasa termoestable (Taq polimerasa, obtenida de Thermus aquaticus): resiste las altas temperaturas del ciclo.
- dNTPs: los cuatro desoxirribonucleótidos que se incorporarán a las nuevas cadenas.
- Tampón y MgCl₂: condiciones iónicas adecuadas para la reacción.
Fases de cada ciclo
La PCR consta de ciclos repetidos de tres etapas:
- Desnaturalización (~95°C): las dos hebras del ADN se separan por calor.
- Hibridación (annealing, ~55-65°C): los cebadores se unen a sus secuencias complementarias en cada hebra.
- Extensión (~72°C): la ADN polimerasa sintetiza la nueva hebra a partir de cada cebador.
Tras 25-35 ciclos, la cantidad de ADN diana se amplifica de forma exponencial: un fragmento inicial genera más de 10 millones de copias.
La PCR no requiere células vivas ni vectores. Amplifica una secuencia específica directamente in vitro, lo que la hace extraordinariamente versátil: diagnóstico de infecciones, genética forense, detección de mutaciones, clonación, secuenciación…
28.6. Electroforesis en gel
La electroforesis en gel de agarosa es la técnica estándar para separar, visualizar y analizar fragmentos de ADN según su tamaño.
El ADN, cargado negativamente, migra a través de un gel de agarosa bajo la acción de un campo eléctrico. Los fragmentos más pequeños atraviesan la malla del gel con mayor facilidad y migran más lejos; los más grandes migran menos.
El resultado se visualiza tiñendo el gel con un agente intercalante fluorescente (como el bromuro de etidio o el SYBR Green) y exponiéndolo a luz ultravioleta. Aparecen bandas que representan los distintos tamaños de fragmentos. Un marcador de peso molecular de referencia permite estimar el tamaño de cada banda.
La electroforesis se usa rutinariamente para verificar el resultado de una digestión con enzimas de restricción, comprobar el producto de una PCR o analizar patrones de fragmentación del ADN.
28.7. Secuenciación del ADN
La secuenciación determina el orden exacto de nucleótidos de una molécula de ADN.
28.7.1. Secuenciación Sanger
El método de Sanger (1977), también llamado método de terminación de cadena, fue el estándar durante décadas. Se basa en la incorporación de dideoxinucleótidos (ddNTPs) marcados durante la síntesis de ADN: al incorporarse, bloquean la extensión de la cadena, generando fragmentos de distintos tamaños que terminan en cada posición posible. El análisis de estos fragmentos permite leer la secuencia.
28.7.2. Secuenciación de nueva generación (NGS)
La NGS (Next Generation Sequencing) engloba tecnologías que permiten secuenciar millones de fragmentos de ADN en paralelo, reduciendo drásticamente el coste y el tiempo respecto a Sanger. Hace posible la secuenciación de genomas completos en días.
La secuenciación del genoma humano completo, completada en 2003 y actualizada con la secuencia completa en 2022, se contextualiza en el T23 — El genoma humano, donde también se explica el número de genes codificantes humanos y la organización del genoma.
28.8. Edición génica: CRISPR-Cas9
28.8.1. Origen y mecanismo
CRISPR-Cas9 es un sistema de edición génica derivado del mecanismo de defensa adaptativa de las bacterias frente a bacteriófagos. Fue adaptado como herramienta de laboratorio por Jennifer Doudna y Emmanuelle Charpentier, quienes recibieron el Nobel de Química en 2020.
El sistema tiene dos componentes esenciales:
- El ARN guía (sgRNA): una molécula de ARN diseñada en el laboratorio que reconoce por complementariedad de bases la secuencia genómica que se quiere editar.
- La proteína Cas9: una nucleasa que el ARN guía dirige hasta la secuencia diana, donde realiza un corte de doble hebra en el ADN.
Una vez producido el corte, la célula lo repara mediante uno de dos mecanismos:
- NHEJ (Non-Homologous End Joining): reparación imprecisa que introduce pequeñas inserciones o deleciones, inactivando el gen. Se usa para knockout.
- HDR (Homology-Directed Repair): reparación dirigida por una secuencia molde suministrada externamente, que permite corregir o reemplazar una secuencia con precisión.
CRISPR-Cas9 permite editar cualquier secuencia del genoma con una precisión, velocidad y coste sin precedentes. A diferencia de herramientas anteriores (ZFN, TALEN), el reconocimiento de la diana se hace por complementariedad de ARN, no por ingeniería proteica — lo que lo hace mucho más accesible y versátil.
28.8.2. Aplicaciones clínicas actuales
En diciembre de 2023, Casgevy (exagamglogene autotemcel) se convirtió en la primera terapia basada en CRISPR-Cas9 aprobada para uso clínico, indicada para la anemia de células falciformes y la beta-talasemia dependiente de transfusiones. Actúa editando ex vivo células madre hematopoyéticas del propio paciente para reactivar la producción de hemoglobina fetal.
A principios de 2026 hay más de 150 ensayos clínicos activos con tecnologías de edición génica, en áreas como oncología, enfermedades cardiovasculares, infecciones virales crónicas y enfermedades raras.
CRISPR-Cas9 puede producir efectos fuera de diana (off-target effects): cortes en secuencias no deseadas con cierta similitud con la diana. Su detección y minimización es una de las principales áreas de mejora activa.
La edición de la línea germinal humana plantea cuestiones éticas de gran calado, ya que los cambios se transmitirían a la descendencia. Está prohibida o fuertemente regulada en la mayoría de países.
28.9. Aplicaciones de la ingeniería genética
28.9.1. Organismos transgénicos
Un organismo transgénico es aquel al que se ha introducido de forma estable un gen exógeno funcional en su genoma. El gen introducido puede ser de la misma especie o de otra distinta.
Las aplicaciones son amplias: producción de proteínas recombinantes de uso farmacéutico (insulina humana en bacterias, eritropoyetina, factores de coagulación), mejora de cultivos agrícolas, investigación básica y modelos de enfermedad.
28.9.2. Modelos knockout
Un organismo knockout tiene uno o varios genes inactivados deliberadamente. Son herramientas fundamentales en investigación básica para estudiar la función de un gen: si su eliminación produce un fenotipo concreto, se puede inferir el papel de ese gen en condiciones normales.
Los ratones knockout son el modelo más utilizado en biomedicina experimental.
28.9.3. Terapia génica
La terapia génica introduce material genético en las células de un paciente para corregir o compensar un defecto genético. Puede actuar añadiendo una copia funcional de un gen defectuoso, silenciando un gen cuya sobreexpresión causa enfermedad, o editando directamente la mutación causante.
Según el tipo de célula diana se distinguen dos modalidades:
La terapia génica somática modifica células no germinales del paciente. Los cambios no son heredables y afectan solo a ese individuo.
La terapia génica germinal modificaría células germinales o embriones, haciendo los cambios heredables. Está prohibida en la mayoría de países por razones éticas.
En diciembre de 2023, la FDA aprobó Casgevy para el tratamiento de la anemia de células falciformes y la beta-talasemia. Es la primera terapia génica basada en edición CRISPR-Cas9 aprobada para uso clínico. El tratamiento edita ex vivo las células madre hematopoyéticas del propio paciente, reactivando la producción de hemoglobina fetal como mecanismo compensador. En ensayos clínicos, 29 de 31 pacientes tratados permanecieron libres de crisis dolorosas graves durante al menos un año tras el tratamiento.
